1.        仪器描述

仪器摆放位置：生物药学楼6^#-207

固定资产编号：201352155

厂商、型号： Eppendorf  New Brunswick BioFlo 310

性能参数：

负责人及联系方式：李亮助 34204631

2.        开机准备

检查电源插头是否插实，检查完后打开BioFlo 310设备开关，接通电源。

3.        发酵前准备

3.1 发酵罐部件检查

3.1.1 请检查发酵罐主控制台、玻璃罐体均能正常工作。

3.1.2 检查罐体各组件是否齐全，各个螺帽中垫圈情况，确保垫圈无损坏，以免密封不好造成染菌。

3.1.3 检查水、电、气情况、确保正常工作。

3.2 pH 电极的标定

3.2.1 根据培养过程中所需要控制pH 的范围选择pH 标准缓冲液。

3.2.2 打开pH 电极帽将电极与缆线相连后与主控制台pH 缆线接口连接。

3.2.3 打开主控制台电源后进入触摸屏界面。第一步：点击Calib。第二步点击PH。第三步，输入6.86（或7.0），将电极放入pH6.86（或7.0）的标准缓冲液中，待点击读书稳定后点击“Set Zero”。第四步输入4.0或9.18（或10），将电极放入相应的的标准缓冲液中，待点击读书稳定后点击“Set Span”。完成pH电极校准。

3.3 DO 电极的标定

3.3.1 打开DO 电极帽将电极与缆线相连后连接于主控制台DO 缆线接口进行电极化，极化时间6 小时以上。

3.3.2 极化完成后，第一步点击Calib。第二步点击DO。第三步；输入0.0，待点击读数稳定后点击“Set Zero”第四步输入100或200，待电极读数稳定后点击“Set Span”。

3.3.3 标定零点，如上（2）第三步标定有三种方法，现介绍如下：第一种方法：将DO 电极与电极缆线断开连接，按上第三步进行，然后将电极与缆线重新连接。第二种方法：需要在标定过程中向培养基中通入氮气，即点击“N2(3) On”将氮气通入罐内液体中，如果没有“N2 (3) On”选项，可以手动操作通入氮气，随后按第三步进行，标定完后点击“N2 (3) Off”或手动关闭通入的氮气。 第三种方法：将DO 电极置于饱和的硫代硫酸钠或亚硫酸钠溶液中，按第三步进行。

注意：以上第一、第二种标定方法可在灭菌后标定；第三种方法必须在灭菌前标定0 点，灭菌后标定斜率。

3.3.4 标定斜率，如第四步。该标定有两种方式：第一种是将pH、温度和搅拌转速参数调节至发酵所需控制参数值，再将通气量调到最大值，待读数稳定后，按第四步进行；第二种是将pH、温度参数调节至发酵所需控制参数值，再将通气量和搅拌转速调到最大值，按图中第四步进行。

注意：DO 斜率标定在灭菌后、接种前进行。

 3.4 酸/ 碱、消泡液和培养基的配制

3.4.1 酸/ 碱配制根据培养过程要控制的pH 值来确定；一般可选的酸为硫酸或磷酸，碱的控制主要为氢氧化钠；硫酸，磷酸使用浓度一般最高不超过10%，NaOH 使用浓度一般为1-3 mol/L。

注意：不要使用盐酸，盐酸会对罐体中金属部件造成腐蚀。

3.4.2 消泡液的选择可根据发酵过程中发酵液成份及所用菌种进行确定。

3.4.3  培养基根据菌种生长过程中对营养物的需要进行配制。

4.        罐体安装

4.1 安装罐盖

4.1.1将挡板放入玻璃罐体内，加入配制的培养基。

4.1.2安装罐盖，手动对角拧紧螺丝帽，保证受力均匀。

注意：拧紧罐盖螺丝帽前确定发酵过程是否需要取样和消泡；如果需要则需同时将取样装置和泡沫收集瓶固定托盘装置（选配）固定于罐盖螺帽处；取样瓶拧到1/2 处，不可拧紧。

4.1.3安装pH、DO 电极，将电极放入罐盖适合孔径中，手动拧紧适配螺母，并盖上电极帽。

4.1.4安装液位电极，将液位电极转接头固定于罐盖板上适合的接口，将液位电极插入，

调整好合适高度，手动拧紧转接螺母固定电极。

备注：BioFlo 310 系列发酵罐配置三个液位电极分别为Level 1、Level 2 和Level 3。其中Level 1 主要用来控制消泡；Level 2 和Level 3 主要用来补料或收集培养液。

4.2 软管连接和包扎

4.2.1将需要连接于发酵罐上和罐体一起灭菌的装置通过软管与罐盖上相应接口连接，主要包括酸瓶、碱瓶、消泡瓶、补料瓶、泡沫收集瓶和取样装置。

4.2.2用铝箔纸将尾气过滤器、通气过滤器、取样处过滤器、酸/ 碱/ 消泡/ 补料瓶口过滤器包扎好。

4.2.3与罐体相连且另一端暴露的软管用纱布加铝箔纸或牛皮纸包扎。

4.2.4检查罐盖上各个软管情况，位于培养基液面下方的管道，在罐盖上方必须夹紧，如通气软管、收集管口软管、取样管等；将加酸、加减、消泡、或补料瓶盖上与罐体相连软管夹紧，确保只留有尾气出口与外界相通。

5.        罐体灭菌

5.1 灭菌前检查

5.1.1 灭菌前请检查罐盖各个接口情况，确保没有直接暴露的端口。

5.1.2 检查位于液面下方管道是否夹紧，尾气出口排气是否顺畅，并包扎完好；检查取样瓶是否拧到1/2 处。

5.1.3 将搅拌轴承帽内边缘涂上硅润滑脂，盖于罐盖中间搅拌轴上，保护轴承。

5.2 罐体灭菌

5.2.1 将罐体放入灭菌锅中进行灭菌，根据培养基情况选择合适的灭菌时间和温度，一般为121°C，20 分钟。

5.2.2 灭菌温度降至80°C 以下后排气，防止在温度过高时排气；冷空气进入灭菌锅内，与热玻璃罐体接触，造成玻璃罐体爆裂。

备注：为避免灭菌时尾气排放管路不通畅导致罐体破裂，可采取以下措施：

5.3.3 将接种口处隔膜片微松开或手动微微拧松罐盖螺帽，灭菌后立即拧紧螺帽。

5.3.4 在尾气冷凝管排气口处接两个无菌过滤器，即将一小节软管与尾气排气口处相连，在软管末端接上三通，将三通另外两端通过软管连接两个无菌过滤器。

6.        主控制台使用

可利用罐体灭菌时间来设置发酵过程相关参数，主控制台参数设定方法介绍如下：

注意：进入操控主界面，首先检查“Summary”界面各参数控制状态“Mode”是否为“Off”状态，如果不是请将其调节为“Off”。

6.1 Summary 主界面

打开电源按钮，首先进入“Summary”界面。

6.1.1 “LoopName”列显示控制参数，气体参数名称中含有“Flo”表示该气体由热质量流量计(TMFC) 来控制流速；点击参数出现参数设定“Gauge”界面。

6.1.2 “PV”表示发酵过程中各参数实际值；“Setpoint”表示各参数设定值；“Out%”表示各参数系统输出百分比；“Mode”表示各参数控制模式；“Units”为各参数单位；“Casc.”表示各参数是否与其他参数有关联。

6.1.3 屏幕显示“Summary”界面后，下方 “Summary”界面按钮被“Synoptic”界面按钮取代；当显示“Synoptic”界面时，下方“Synoptic”界面按钮被“Summary”界面按钮取代；当屏幕显示界面为其他界面时，如“Trend”界面，最左端则显示“Summary”按钮。

6.1.4 当通过主控制台添加新设备时，可在“Summary”界面中“LoopName”栏空白处添加相关控制参数；步骤如下：

a.点击“LoopName”栏空白方框，出现下图界面，点击“Name”左边文本框出现下图字母键盘界面，可设定参数名称；“Units”为参数单位。

b.“Loop Type”栏中选择参数类型，“Units”中自动出现或手动输入相应单位；

c. 根据主控制台后部模拟输入/ 输出模块接入情况，在“Input Device”和“Output Device”中选择对应Analog 位置。

备注：第一步，输入参数名称。第二步，选择参数类型。第三步，选择相应的模拟输入端口。第四步，选择相应的模拟输出端口。第五步，设定参数P&I值和范围。第六步，点击“OK”保存设置。

d.“Control Settings”栏中设定参数P&I 值(“PGain”和“IGain”)、参数上下限范围(“SP Low Limit”和“SP High Limit”) 和一般常量(“Norm. Const.”)；

e.设置完成后点击“OK”按钮，取消设置点击“Cancel”。

如需移除添加参数，请按下述步骤操作：

① 移除非蠕动泵参数：进入“Summary”界面，点击需要移除的参数，显示该参数的Gauge 界面如下图，点击界面中“User Settings”按钮，将出现上图参数设定界面，点击“Remove”移除添加参数。

② 移除蠕动泵参数：进入“Pumps”界面，点击外加泵“Control Mode”栏“On”键旁边“Settings”按钮，弹出界面中点击“Remove”移除添加参数。

 6.2 Synoptic 界面

“Synoptic” 界面主要功能以流程图的形式表示发酵过程中各个参数设定值和实际值，具体介绍如下：

6.2.1 参数颜色为红色表示控制模式为“Off”；参数颜色为绿色表示控制模式为“On”；参数颜色为蓝色表示控制模式为“Manual”。

6.2.2 液位电极有两种状态，红色表示“Dry”，绿色表示“Wet”。

6.2.3 界面中，阀门图标红色表示关闭，绿色表示开启；泵图标红色表示“Off”，绿色表示“On”。

6.2.4 点击相应参数框如“AirFlo(1)”、 “Temp”等将会出现参数的设定界面（“Gauge Screen”界面）；点击泵图标出现“Pumps” 界面。

6.3 Gauge 界面

“Gauge” 界面主要功能为各个参数设定值、控制模式和P&I 值。可在“Summary”界面中点击参数所在行，或在“Synoptic”

6.3.1 点击 “Setpoint”下方文本框；点击后将出现下图界面，该界面中点击要设定的数字键后，点击“OK”键确定输入；如果想重新输入点击“Clear”键，取消更改则点击“Cancel”键返回输入前的界面。

6.3.2 点击 “Off”、“Auto”或“Manual”选择转速控制模式，分别表示关闭、自动控制和手动控制；“Proportional”和“Integral”为系统设定值，请勿随意修改。 “ Temp”、“pH”、“DO”、“Air Flo(1)”、“O2 Flo(2)”和“GasFlo”等其他参数设定可参考上述方法。

6.4  Calibration 校正界面

该界面功能为标定pH、 DO 和液位电极；pH/DO 电极标定见2.2 和2.3 节内容。液位电极设定界面，使用方法如下：

6.4.1  “Level Sens.1”主要用来消泡，该电极位于液位上方。当泡沫接触到电极探头，与该电极关联的消泡泵开启并泵入消泡液，当“Raw Value”值变为Dry 后泵停止工作。关联泵的设置：点击“Pumps”界面按钮，选择关联泵这一栏中“Assignment”按钮，点击“Foam/Lvl1”。

6.4.2 “Level Sens.2”和“Level Sens.3”用来加入液体或收获发酵液。

a. 当用作加入液体时，关联泵的设定：点击“Pumps”界面按钮，选择关联泵这一栏中的“Assignment”按钮，点击“Lvl2/Dry”或“Lvl3/Dry”；当该液位电极高于液面时，与其关联的泵开启，泵入液体，电极头浸入液体时，泵停止工作。

b. 当用作收获发酵液时，关联泵设定：点击“Pumps”界面按钮，选择关联泵这一栏中“Assignment”按钮，点击“Lvl2/Wet”或“Lvl3/Wet”；当电极探头浸入发酵液时，与该电极关联泵自动开启泵出发酵液，电极头高于液位时， 泵停止工作。

6.5 Cascade 关联界面

该界面主要进行参数关联控制设定，以DO 界面为例介绍如下：

6.5.1 “Cascade From”为选择被关联控制的参数。“To”为与“Cascade From”参数中可关联的参数。

6.5.2 “Enable”列按钮有两种状态为“YES”和“NO”，表示确定关联与否。“Start Setpoint”关联参数起始值，一般为工艺参数设定值。

6.5.3 “@ DO Strat Out%”表示系统DO 中“Out%”达到该设定值时开始进行关联控制。

6.5.4 “End Setpoint”表示当系统“Out%”值达到“@ DO End Out%”值时该参数所允许的最大值。

6.5.5 “@ DO End Out%”表示系统DO中“Out%”值达到或高于“@ DO End Out%”中设定值时停止关联，该参数将保持“End Setpoint”中设定值。

实例：说明关联控制过程，设置的关联参数为溶氧“DO”，与其关联的参数为搅拌“Agit”、流速“GalFlo”和氧气“O2(2)”：

a. 当溶氧值“PV”低于设定值“Setpoint”时，DO 的“Out%”值增加；DO 的“Out%”值达到设定“@ DO Strat Out%”和 “@ DO End Out%”范围内时，搅拌转速将从250 rpm 增加到1000 rpm。

b. 若转速关联仍无法让DO 值维持在设定值，DO 的“Out%”值将大于25%( 即在25%-100%间变动时)，气体流速“GasFlo”将开始增加，气体流速将在5 SLPM-20 SLPM 范围内变化。

c. 若转速和通气量增加仍然无法将DO 值稳定在设定值时，即DO 的“Out%”值在50%-100%间变动时，控制台将增加通气量中氧气“O2(2)”的比例来提高DO 值，氧气比例变化范围为0%-100%。

注意：“@ DO Strat Out%”值设定有两种常见情况： -100 和 0。

a. 设定为-100 情况：溶氧电极标定完成后，DO 值读数一般高于设定值；此时“Summary”界面中“DO”参数的“Out%”值变为-100%，系统默认应该降低DO 参数值；如果“PV”值低于“Setpoint”值时，关联控制将会启动。

b. 设定为0 情况：在接种前或关联前，系统DO 参数值等于设定值时可以将“@ DO Strat Out%”值设定为0，以便更好的进行关联控制。

6.6 Trend 趋势界面

该界面功能为设置参数趋势图相关情况；能够记录8个参数的趋势变化曲线，记录最长时间为144小时；并且可以通过主控制台的USB端口将数据以Excel的格式导出或是通过RS232/422通信端口与辅助计算机相连进行过程数据的存储，界面功能介绍如下：

6.6.1  “Setup”栏显示不同颜色按钮，点击任意按钮( 如第1 个红色按钮)

a. 选择红色按钮要分配的参数，如果想要更改参数显示颜色可在“Display Color”栏中选择相应的颜色；

b. 设定该参数的“Display High”和“Display Low”值，即纵坐标刻度范围；

c. “Sample Rate(Secs)”中选择采样间隔时间，有5、15、30 和60 几个参数可选；完成后点击“OK”按钮，或点击“Cancel”返回先前界面。

6.6.2 “Setup”下方列出参数“PV”、“SP”和“OU”值，分别表示当前值、设定值和系统输出百分比。

6.6.3 “Summary”按钮显示趋势线不同界面，一般所设定的八组参数可同时显示。第一次点击“Summary”按钮后显示前4个参数趋势线，第二次点击该按钮后显示后4 个参数趋势线，若再次点击该按钮后返回8 组参数同时显示界面。

6.6.4 “Single”按钮功能为依次显示单一参数趋势线。

6.6.5 “Export”按钮功能为以Excel 文件格式输出趋势线中所有参数的数据；即连接移动数据盘插至主控制台USB 端口；点击“Export”按钮，在弹出界面 “Drives”文本框中选择存储设备；点击“Filename”文本框输入文件名称；点击“Save”按钮保存。

6.6.6 “《《《”和“》》》”按钮功能为改变中间文本框中时间值，即趋势图中横坐标时间轴范围。

6.6.7 点击“Zoom”按钮后，该按钮以红色显示；连续点击趋势线需要放大显示目标处上下两点，如下图所示；屏幕中将放大显示两点击处数据；再次点击“Zoom”按钮后，将返回先前状态。

6.6.8 点击“Read Line”按钮后，按钮以红色显示，两边灰色按钮将变红色为可用；通过点击趋势线中想要显示处或通过“Read Line”两边红色按钮来移动竖线位置，显示该处参数“PV”值；再次点击“Read Line”按钮时，将返回先前界面。

6.6.9 “Clear”按钮的功能为清除界面中记录的趋势线图。

6.7  Pumps 蠕动泵界面

界面中显示系统内置的三个泵，若有外接泵，则点击左侧“《《《”或“》》》 ”按钮来显示；通过该界面设定各个泵的参数值，以“Pump1”为例来说明泵的使用：

6.7.1 “Assignment”表示为泵分配任务，点击该按钮后会出现右侧小界面，选择相应选项设置泵功能。“None”表示不为泵分配任务，“Acid”表示泵任务为加酸，“Base”表示泵任务为加碱；“Foam/Lvl1”、“Lvl2/Wet”、“Lvl2 Dry” 、“Lvl3/Wet”和“Lvl3 Dry”功能详见第5.4 节内容。

6.7.2 泵界面中，“Setpoint”功能为设定泵工作时间或工作强度：

a. 当该泵“Assignment”设定为“None”、“Foam/Lvl1”、“Lvl2/Wet”或“Lvl2 Dry”，与最下方“Period(Sec)”对应。“Period(Sec)”表示泵工作周期，以秒为单位。如上图 “Period(Sec)”设定值为10，如果在“Setpoint”框中输入50%，表示“Pump1”每工作5 秒停止5 秒。

b.当该泵“Assignment”设定为“Acid”或“Base”，泵工作时间受系统PI 控制，进行微调控加酸、碱保持pH 恒定。

6.7.3 “Control Mode”栏中，“Off”表示泵处在关闭状态，“On”表示泵将按设定的参数自动工作，“Prime”表示手动开关泵，按住“Prime”按钮时泵将持续运行，当停止按住该按钮时泵将停止运行。

6.7.4 “Flow Rate”栏主要功能是泵流速标定。“Calibrate”按钮为泵标定流速，“Reset”按钮为清除 “Total”值。泵在一般情况依照固定速度运转，流速随着软管的内径不同而变化，下表中给出不同软管内径对应的泵流速。

如果您更换软管后需要对泵流速进行校正，确保泵在加酸、加碱或补料过程中控制准确，流速标定过程如下：

a.准备好需要用的软管，并将软管接入泵中。

b.将软管输入端放入一个装有水的烧杯中，将软管输出端置于量筒中，用于记录泵出水的体积。

c.点击“Pumps”按钮进入泵界面，点击待标定泵“Prime”按钮，泵开始运行并排出管道内气体，并将水泵入管道内，待管道内气体排完后开始流出水时关闭泵，并避免水泵入量筒内。

d.点击“Pumps”界面中待标定泵的“Calibrate”按钮，选择泵运行时间，然后点击“Start”按钮，泵开始工作，时间完后泵停止工作，记录量筒内水的体积，然后将该值输入“Set”按钮左侧文本框，点击“Set 按钮”保存输入值，并回到“Pumps”界面，完成泵标定，“Calibrated”下方框中出现标定好的流速。

6.8 Alarms 报警界面

该界面用来设定报警提示：

6.8.1 “LoopName”列为可设定报警提示的参数。

6.8.2 “ABS Low”表示控制参数最低设定值；“ABS High” 表示控制参数最高设定值；当参数“PV”值低于“ABS Low”或高于“ABS High”将启动系统报警。

6.8.3 “ABS Enable”表示可将该参数设定为报警提示状态，“InActive”表示不作报警提示，“Active” 表示作报警提示。

6.8.4 “DEV Low” 表示所允许控制参数“PV”值低于设定值的偏差低限；“DEV High”表示所允许控制参数“PV”值高于设定值的偏差高限；“DEV Enable” 表示可将该参数设定为报警提示状态。

6.8.5 点击“Acknowledge All”按钮表示默认所有报警参数并停止报警。

6.8.6 点击“Current Alarms”按钮显示目前正在报警的参数界面。

6.8.7 点击“History”按钮显示所有参数报警的历史记录。

在 “LoopName”列中点击该列中参数，或点击参数设定“Gauge”界面中“Alarm Settings”按钮，进入该参数报警设定界面；以转速“Agit”为例介绍如下：

a.       “Selected Loop”栏显示转速设定值和实际值；点击“Absolute”栏文本框输入“Low Limit”和“High Limit”设定值；点击 “Enable”或“Audible”或两者都选，选择报警提示方式；

备注：“Enable”表示以红色提示报警，“Audible”表示以警示音提示报警。

b. 点击“Deviation”栏文本框输入“Low Limit”和“High Limit”设定值；点击“Enable”或“Audible”或两者都选，选择报警提示方式；点击“《《《”按钮返回先前界面。

c. 点击“Current Alarms”按钮显示该参数正在报警情况界面。点击“Alarm History”按钮显示该参数报警的历史记录。当某一参数处于报警状态时，“Summary”界面中该参数的“LoopName”栏按钮为红色，界面名称按钮以红色显示；屏幕左下角标注报警提示。报警提示将一直显示，直到参数值回归正常。此外可以通过点击“Alarms”界面 中“Acknowledge All”按钮，解除所有参数报警提示。

注意：解除报警并非修正触发报警的参数值，应该及时根据报警提示修改相关参数值，使BioFlo 310 恢复正常运行状态。

6.9 Setup 设定界面

该界面主要是用来设定系统参数，由五个子选项组成，分别为“Controller Setup” 、“Recipe Manager”、“System Settings”、“Hardware Setup” 和“Security Settings”。点击“Setup”按钮后，首先进入的界面为“Controller Setup”界面

6.9.1 Controller Setup 界面：点击“Unit Name”处文本框，出现字母键盘界面。在界面中， 输入命名的字母或数字后点击“OK”后，回到先前界面。参数设定完成后点击“Save Changes”按钮保存更改。

6.9.2 Recipe Manager 界面：保存系统中所有参数设置情况，如设定值，控制模式，报警，P&I 值和参数关联设置等，即保存操作方案；如下图界面中“Available Recipe”下方框中列出系统保存的方案名称，最多可保存10 组方案。Save”按钮功能为保存方案，点击该按钮将沿用原有文件名；“Save As”按钮功能为保存方案并重新命名。“Load”为载入方案，在“Selected Recipe”下方框中选择方案文件，随后点击“Load”按钮载入选中方案。“Delete”为删除方案按钮，即首先在“Selected Recipe”下方框中选择方案文件，随后点击“Delete”按钮删除选中的方案。“Load Default”按钮为载入原始系统设定值；若系统设定过于乱，可通过该按钮恢复出厂设置。

6.9.3 System Settings 界面：可根据需要选择系统语言、校正触摸屏、设定系统时间和进行系统软件更新。

注意：更新系统软件前，请先备份系统中的重要数据，以免丢失。

6.9.4 Hardware Setup 界面：BioFlo310 主控台至多可再添加3 台附加控制台，即4 台发酵罐由一个主控制台控制。“Hardware Setup”界面主要功能是显示主控制台机器的配置情况，及附加控制台配置和连接情况。

6.9.5 Security Setting 界面：BioFlo 310中，系统提供两种用户使用权限，分别为“Administrators”和“Operators”，即管理者权限和操作者权限。操作者可以进行常规操作，不能改变安全设置；管理者可以进行所有操作，包括增加新的操作者和设定安全密码；系统默认管理员名称为Admin，起始密码为ADMIN。

当“Enable Security Feature”框被选中时，“BioFlo 310”左侧将出现“User”按钮。“Add User”按钮为增加新用户，点击该按钮出现下图界面，输入用户名和密码后点击“OK”。“Remove User”按钮为删除已有账户，即在“Administrators”或“Operators”框中选择要删除的用户名，点击“Remove User”。

“Automatic Log Off Time”的功能为锁定操作界面，即触摸屏界面待机时间达到“Automatic Log Off Time”栏中设定时间，系统只留有“Summary”、“Synoptic”和“Tend”界面供选择。

“Security Setting”界面“<<”和”>>”钮功能为改变操作权限，即当以管理员身份进入后，可以通过”>>”按钮将

“Administrators”栏中的管理者变为“Operators”栏中的操作者；或是通过”<<”按钮将“Operators”栏中的操作者变为“Administrators”栏中的管理者。

根据上述介绍将相关发酵参数设为发酵工艺所需要的参数值。

7.        灭菌后罐体安装

灭菌结束后，待灭菌锅温度下降到80°C以下后取出罐体，避免热玻璃罐体遇到冷空气导致罐体破裂。取出罐体置于控制台旁，按下述步骤操作：

7.1 灭菌完后，拧紧取样瓶，加固灭菌前未拧紧的螺帽。

7.2 将排水管线与主控制台相连，底部冷却夹套和尾气冷凝管进/ 回水管线与主控制台相连，确保连接牢固；连接好后将尾气冷凝进/ 回水管、底部夹套进/ 回水管与快速接头相连；最后将进水管路与主控制台相连，打开进水阀。

备注：进水压力范围为5-10 PSIG（约0.03-0.07 MPa）。

7.3 将温度电极放入热电偶套管中，向套管中加入1-2ml 甘油确保良好导热。

7.4 安装搅拌马达于罐盖中部，确保连接到位、稳固。

7.5 将温度和转速控制模式调为“Auto”，此时底部冷却夹套和尾气冷凝器中将进入冷却水。

7.6 连接好气体管路，向罐内通入少量气体；打开软管夹，将气体缓慢放入罐内；打开各个软管夹，将灭菌时软管内冲入的液体压回罐内。

备注：进气压力范围为3-10 PSIG（约0.02-0.07 MPa）。

7.7 将酸、碱、消泡或补料软管接入相应泵中。

7.8 将pH、DO 和消泡/ 液位电极通过缆线与主控制台相连。

7.9 验证pH 电极标定情况：待培养基温度降至室温后，记录“Summary”界面中pH 值；从发酵罐中取出少量培养基，用额外的pH仪测定培养液pH值；如果两者pH值有差距，进入“Calibration”界面，点击“pH”，将测定的pH值输入“Set Zero”下方的文本框中，点击“Set Zero”。

警告：请不要改变“Set Span”值，否则pH 电极标定将无效。

7.10 标定DO 电极，标定方法见2.3 DO 电极标定。

7.11 确保各个管路连接无误后，将各个参数控制模式设为自动控制。

8.        发酵过程

待各发酵参数达到工艺设定值后，可以接种进行发酵实验。

8.1 接入菌种

BioFlo 310 发酵罐有两种途径可将菌种接入发酵罐：

8.1.1 第一种接种方式：将培养好菌种转入无菌接种注射器中；将注射器插入接种口处隔膜注入菌种；操作过程确保无菌。

8.1.2 第二种接种方式：将培养好菌种转入无菌加液瓶中，将加液瓶的软管与罐盖顶部相应端口相连，如收获管道端口等，将菌种泵入发酵罐中，操作确保无菌。

8.2 过程取样

为了解菌种生长和产出情况，需要在发酵过程中取出部分发酵液，进行相关成分的分析，取样过程如下：

8.2.1 压紧吸气球，打开连接取样管处阀门，让吸气球膨胀，发酵罐中液体流入取样瓶；

8.2.2 取足液体后关闭连接取样管处阀门，拧下取样瓶，并换上干净无菌取样瓶，完成整个取样过程。

8.3 发酵过程

一个典型的发酵周期，即菌体生长周期分为：延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期。发酵方式分为批次发酵、补料分批发酵和连续发酵。

8.4 发酵液收集

发酵完成后，可通过液位电极来完成发酵液的收集过程，液位电极以及相应泵的设置参考第6.4 节内容；设定好后，泵自动开启将发酵液泵入收集瓶中。

9.        卸罐和清洗

发酵结束后，请按下述步骤卸载发酵罐：

9.1 将“Summary”界面中各参数控制模式调为“Off”。

9.2 关闭通气阀、进水，断开罐体与控制台连接的连接线。

9.3 从罐盖上小心卸载pH 和DO 电极，用去离子水冲洗干净，pH 电极置于3 mol/L 的KCl 中保存，DO 电极盖上电极头保护帽后放置电极盒中。

9.4 电极卸载完成后将罐盖中其他部件依次卸载下来，卸载过程中注意保护玻璃罐体，避免打碎。

9.5 将罐体和卸下的尾气冷凝管以及罐盖上组件放入洗涤液浸泡大约1 小时后，用软刷彻底洗刷罐体；完成后用自来水冲洗罐体至干净，再用蒸馏水或去离子水冲洗罐体2-3 次；完成清洗，晾干罐体备用。

9.6 对于主控制台可根据使用情况，用湿布擦拭表面保持洁净；对于罐体组件每月应整体清洁，包括罐盖上面各个垫圈组件，以防止染菌。

警告：清洗罐体不要使用强腐蚀或有毒化学物质，避免对罐体造成腐蚀。

10.    保养和储存

将发酵罐置于合适的工作环境中，并定期进行维护，可保证发酵罐长久使用，建议操作如下：

10.1 pH 电极长时间使用后可能发生读数不稳定或读数不准确等情况；检查并排除连接缆线、接口问题或电极是否有损坏；若损坏请及时更换，防止对实验造成影响；使用pH 电极后，请确保电极头部置于3mol/L KCl 中保存。

10.2 DO 电极膜具有使用寿命，每次做实验前向电极膜内加入1-2 滴电解液，建议每三个月更换电解液；此外定期检查溶氧电极膜情况，若发现堵塞或破损请及时更换。

注意：DO 电极中的电解液为强碱性溶液，如果有少量电解液溅在皮肤上，应及时用水冲洗；电解液不可接触眼睛，如果电解液进入眼睛，立即用大量清水冲洗眼部；如眼睛出现异常( 例如红肿、疼痛、视线模糊等)，马上到医院就医。

10.3 每三个月定期检查发酵罐各个组件情况，检查前请确保断开电源连接，确保安全。